第三节 单基因遗传病及相关检测技术01
我国是人口大国，也是出生缺陷发生率较高的国家。据估计，我国出生缺陷发生率在5。6%左右，每年新增出生缺陷数约90万例，其中单基因病约占0。38%。
单基因疾病是由单一基因异常引起的，并以传统孟德尔模式遗传：常染色体显性、常染色体隐性、X连锁隐性、X连锁显性和非传统孟德尔遗传的母系遗传等。以常染色体显性遗传为例，男女子代发病风险均为50%，可能会导致疾病在家族中代代遗传的现象。
单基因遗传病发生的主要原因是基因序列的改变导致蛋白质数量或功能异常。可能存在单个错义突变（将一个核苷酸换成另一个）、一个或多个核苷酸的插入、一个或多个核苷酸的缺失、基因部分的扩增或基因内的其他重排及甲基化异常。根据突变位点的不同，其编码的蛋白质表达受阻，或者其蛋白稳定性、结构可能发生改变，进而导致蛋白质活性发生改变（更高或更低的活性），而不影响蛋白质功能的同义突变绝大多数都是不致病的，但某些看似“同义突变”的变异可能会影响信使核糖核酸（mRNA）的剪接，是致病性的。
一、单基因遗传病遗传模式与家系分析原则
常染色体显性遗传病是22对常染色体中的一对基因中的一个发生异常的结果。患有常染色体显性遗传病的个体，其子代有50%的机会遗传其异常变异并表现出表型。在部分情况下，没有家族史的患者，可能是新发突变所致。因此，没有阳性家族史并不排除常染色体显性遗传病。通常，常染色体显性疾病涉及结构蛋白或相关受体，其家系内可能存在表型差异，表现程度不同（表型异质）。例如，受影响非常轻微的父母可能有一个受影响更严重的子代。例如Treacher-s综合征是一种表型差异较强的常见颅面疾病，导致这种现象的机理尚不明确。
常染色体隐性遗传病是基因两个拷贝发生异常的结果，分别从双亲传递而来。父母各有一个正常和一个异常拷贝等位基因，为无症状携带者。携带者夫妇每次怀孕都有25%的风险生下受累男婴或女婴。通常，常染色体隐性疾病通常涉及酶类蛋白的合成。这些酶缺乏导致先天性代谢障碍以及多发畸形等综合征。例如，Smith-Lemli-Opitz综合征包括小头畸形、腭裂、特征性面部外观、心脏缺陷、男性**异常、多指，以及生长发育和智力发育迟缓，其原因是胆固醇代谢通路发生异常。
X连锁疾病，顾名思义是由位于X染色体上的基因异常引起的。据文献统计，患有X连锁疾病的男性比女性更易发生症状。携带有一个X连锁隐性异常基因的女性可能只有轻微症状或无症状，而男性则表现出完全的症状，这种差异现象是X随机失活所导致，其女性的一条X染色体在发育早期发生了失活。相比之下，患有X连锁显性遗传病的女性会有症状。一些X连锁显性疾病，如Rett综合征，其基因的失活导致男性胚胎发育发生阻滞。在X连锁遗传中，由于男性子代从母亲那里获得X染色体，携带者母亲的每个男性子代都有50%的机会遗传异常基因，其女性子代都有50%的概率遗传异常基因而成携带者，50%的概率遗传正常基因。而一个患有X染色体连锁疾病的男性如果能够生育，就会将异常的X连锁等位基因传给他的每个女性子代，她们将成为致病基因的携带者，而男性子代都不会继承其异常基因（儿子从父亲那里承接的是Y染色体）。受累男性通过携带者女儿将缺陷基因传递给外孙，可能有一半的外孙受累，血友病就是一种X连锁遗传的典型例子。
二、经典单基因病检测技术
目前已被美国国家生物技术信息中心（NCBI）正式收录的相关基因有23000多种，分子机制明确的有4500多种，包括常染色显性、隐性及X连锁遗传病。单基因病虽然发病率低，但是种类多，所以合并数量众多，对患者家庭乃至社会造成沉重负担。临**迫切需要对这一类患者及家庭提供有效的检测及咨询，对婚育进行指导，避免遗传病的再发。随着遗传学和分子生物学技术的发展，越来越多的疾病基因或候选基因被识别，基因突变与疾病的关系也逐渐明确。基因诊断已经逐步应用于临床。目前用于检测基因突变的方法很多，如Sanger测序、MLPA、实时荧光定量PGS）等。
（一）Sanger测序
Sanger测序也称为双脱氧测序或链终止反应。它是基于添加双脱氧核苷酸（ddNTPs），通过DNA聚合酶，用于扩增反应。不同颜色荧光团标记ddNTPs使自动化DNA测序成为可能。在这种技术中，经过一系列的扩增后，片段被分离纯化以去除未结合的游离荧光成分，然后通过毛细管分离电泳。最后将结果与数据库中参考序列进行比较。
Sanger测序是被广泛用作分子诊断的金标准，也用作高通量测序结果的验证。它可以检测序列上的点突变和微小插入缺失变异，并且需谨慎解释其测序检出的结果。在隐性遗传的疾病中，由于可能影响基因诊断（尤其是遗传咨询和产前检查诊断）的结论，所以需家系验证其两种致病性突变是否位于不同的等位基因（反式）。如果两种突变都存在于同一等位基因（顺式）中，受检者还有另一个未知的突变没有检测到，一般用其父母双方的DNA进行测序分析。此外，在对意义未明的变异进行诊断报告前，其对剪接或蛋白质活性或定位可能的影响需要进行计算机预测分析，选择性剪接位点可以通过RNA水平的A测序进行验证。
（二）多重连接探针扩增技术（MLPA）
MLPA是一种高通量探针连接后的PCR扩增技术，这些方法是基于将不同长度的探针与目标序列杂交，然后通过连接酶将杂交后的引物连接并进行PCR扩增，随后通过毛细管电泳分离扩增片段，并通过分析受检者样品和对照样品之间峰值信号的高低进行运算，获得待检测片段的拷贝数。MLPA能够检测异常拷贝数变异，如基因组序列中缺失和重复片段。逆转录MLPA（RT-MLPA）和甲基化特异性MLPA（MS-MLPA）是该技术的另外应用方向，用于mRNA表达水平和甲基化水平的分析。
MLPA检测的一个重要的局限性，在于遗传变异对探针杂交效率的影响。探针与目标序列的不匹配，可能导致探针信号的降低或丢失，进而错误地判断其片段缺失。因此，有必要使用另一种方法或使用一组不同的探针进行结果确认，尤其是缺失片段中只涉及一个探针时。建议对探针覆盖的外显子进行序列分析，确定患者在该区域存在的未知致病性基因变异。
（三）实时荧光定量PCR（RealtimePCR）
实时荧光定量PCR基于PCR扩增的同时对荧光标记靶序列进行检测或定量。其主要应用于4SNP基因分型、拷贝数变异（V）分析和基因表达等。
荧光标记有两种主要策略：双链DNA（dsDNA）结合染料和荧光标记引物或探针，其中最常使用的双链DNA染料为SYBRgreen。它非特异性地与双链DNA结合并发出比染料在溶液中游离时强得多的荧光信号。其设计分析相对简单，并且具有较低的经济成本。此外，它还可用于分析溶解曲线、荧光图强度与温度的关系，并检查扩增子的特异性。然而，由于它所使用的荧光是单个通道发出的，因此仅限于分辨单个扩增反应，其非特异扩增和引物的扩增二聚体也会影响其定量分析。关于标记探针检测，应用最广泛的属于Taqman探针。由于探针是由5’端的荧光报告染料和3’端的猝灭染料组成，具有特异性的靶向寡核苷酸。未扩增前的探针，其报告荧光基团因其接近猝灭剂而发生猝灭。在扩增过程中，探针与DNA杂交并被聚合酶的5’和3’端核酸外切酶活性切割，荧光基团释放，并随着扩增片段数量的增加，其释放的报告基团和荧光信号成比例增加。虽然Taqman探针比双链DNA染料更加昂贵，但可以提高检测通量、降低成本，并缩短多重反应的检测分析时间，而且它对低拷贝数的目标序列检测也更加敏感。
（四）高通量测序（NGS）
在过去的40多年中，Sanger测序，无论是凝胶测序还是毛细管测序电泳，都被认定为分子诊断中鉴定目标序列变异的金标准。然而，这种通过外显子测序来分析单个基因和外显子的传统分析方法，已经逐渐被更具成本效益和时间效益的替代方案超越。
高通量测序技术，也称为二代测序，允许在短时间内对基因组区域进行测序而且成本相对较低。当前存在着不同原理的平台，使用不同的化学反应，可以对数以百万计的DNA小片段进行并行测序。其中应用最广泛的包括：罗氏454平台使用的焦磷酸测序法；Solexa平台的边合成边测序法（现Illumina）；基于离子pH改变的半导体测序技术（ThermoStific）；华大平台的边连接边测序法。这些方法尽管有其内在差异，但都依赖于由短DNA片段组成的DNA文库进行测序，然后根据参考基因组序列进行排序和组装，因此生物信息学成为数据分析中非常重要的一部分。
NGS的应用包括对PCR扩增的基因组区域进行测序、全外显子组测序（WES）和全基因组测序（WGS）。其中对于产前运用全外显子组测序的解读还有很多问题需要解决，其中包括检出大量的临床意义未明的变异。当向患者报告临床意义未明的变异时，可能会引起他们严重的焦虑，并使临床决策具有很高的挑战性。不同的产前诊断中心依赖于自身的实验室报告，这些报告可能具有较大的室间差异。并且报告依赖于实验室人员单个的文献搜索，这可能导致分析流程烦琐，耗时且范围有限。鉴于未来越来越多的家庭要求采用WESWGS对胎儿先天性异常进行基因诊断，并且大多数与特定胎儿表型相关的系统分类变异基因都很少，因此有迫切的科学研究需求，需要对产前胎儿基因组的相关基因和变异进行校正。虽然WGS当前不是常规临床诊断的一部分，但在研究复杂疑难疾病中的病因中体现出巨大的价值。另外，WGS由于其成本的不断降低，已成为许多地方的常规诊断程序，未来可能成为分子诊断的首选。伦理方面与偶然发现的变异披露有关（即发现致病性），然而与目标表型无关联的基因致病性突变是WES检测报告的主要挑战之一。
NGS在人类遗传性疾病的分子诊断方面具有广泛的临床应用价值，包括单基因疾病、多基因疾病、基因组疾病等。例如靶向测序，其主要优点是可以在疑似某种疾病的条件下，同时分析导致其表型的众多基因。对于WES而言，可以在没有明确临床诊断的情况下，对所有基因的外显子进行筛查并确定其遗传诊断。连同WGS方法，这些技术正在协助我们对罕见的孟德尔疾病进行致病突变的鉴定，并扩大这类罕见综合征型疾病的表型谱。
三、单基因病与胎儿发育异常